Rapidez y sensibilidad analítica: un mismo reto para el coronavirus y los controles alimentarios

Autor: Javi Butrón, responsable del Departamento de Biotecnología de CNTA
jbutron@cnta.es

Durante estos días en los que el COVID-19 está inevitablemente de actualidad, hemos podido escuchar mucho acerca de la importancia de las pruebas diagnósticas y de la naturaleza crítica de la sensibilidad y la rapidez en las mismas. La necesidad de estas pruebas ha fomentado que la tecnología analítica sea más relevante y esté más presente que nunca en nuestros periódicos y telediarios, así como en redes sociales.

Profundizar en el conocimiento de estas tipologías de pruebas puede ayudarnos a entender sus futuras utilizaciones también en el sector alimentario. La industria agroalimentaria y el ámbito sanitario comparten paralelismos al respecto de estas técnicas. Por un lado, en lo que se refiere al reto de nuevos desarrollos que respondan a los mencionados parámetros de rapidez y sensibilidad y, por otro, en la función y el uso de estas técnicas analíticas en el día a día de los laboratorios.

 

Los test y su aplicación en la alerta sanitaria del COVID-19

Actualmente tenemos, simplificando, tres tipologías de herramientas diferentes de diagnóstico con las que se está afrontando el escenario del COVID-19. Oímos constantemente hablar de PCRs y test rápidos, pero ¿Qué son y cómo funcionan? ¿Cuáles son sus diferencias? Y lo que es más importante, ¿somos conscientes de que, aunque pueden solaparse en determinados momentos, también pueden estar enfocados a diferentes funciones de diagnóstico y contención?

Un punto fundamental en el que están insistiendo los profesionales es que independientemente de los test usados, los resultados de los mismos no deben en ningún caso ser la base única de la toma de decisiones. Por ellos nos insisten en que un resultado, principalmente en el caso de negativos, debe combinarse siempre con las observaciones clínicas, el historial de los pacientes y los datos epidemiológicos disponibles.

Si entendemos la forma de trabajar de estas pruebas podremos ver y entender las diferentes potencialidades y objetivos. Nos gusta siempre la seguridad, creer que tenemos todo controlado y que siempre está disponible el sistema perfecto para cada situación. La realidad nos enseña que en ocasiones debemos trabajar con las herramientas existentes, aunque a futuro puedan desarrollarse otras mejores. En esas ocasiones no podemos detenernos, debemos sacarles el partido oportuno conociendo sus fortalezas y debilidades. No olvidemos que todas las pruebas existentes se desarrollan a tiempo real con la epidemia, bajo lo que se llama en algunos países “Autorizaciones de Uso de Emergencia”. Y aunque no van a tener el bagaje y precisión de pruebas clínicas perfeccionadas durante años frente a otros patógenos, son la herramienta de información de la que disponen en la primera línea de atención sanitaria.

 

¿Cuáles son las características del COVID-19? Así “atacan” las diferentes pruebas

El enemigo contra el que nos enfrentamos es un virus de tipo ARN (Ácido ribonucleico o RNA) de cadena sencilla (+ssRNA). Básicamente es un núcleo de ARN encapsulado, dentro de una cubierta esférica de lípidos y espinas de glucoproteínas de apenas 60-140 nm. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK554776/figure/article-52171.image.f3/)

Esta naturaleza condiciona la búsqueda del virus SARS-CoV-2 agente del COVID-19 o su consecuencia en el organismo. Aparte de la función diagnóstica común, los tres sistemas tienen enfoques distintos cuya información va a ser necesario combinar, a la hora de contener y controlar la pandemia, no en su fase de emergencia, sino además a largo plazo, merced a obtener datos epidemiológicos más profundos.

  • Técnicas PCR.

La reacción en cadena de la polimerasa (Polimerase Chain Reaction – PCR) es una herramienta analítica muy potente, ya que en general se considera que ofrece una alta sensibilidad. En teoría, es capaz de detectar unas pocas moléculas de material genético (en el caso particular del virus, su ARN) si están presentes en la muestra. Vamos a tomarlas y a copiarlas millones de veces de forma que podamos visualizarlas.

La PCR se basa en “tomar prestada” en el laboratorio partes de toda esa “maquinaria” biológica que las células vivas utilizan para duplicar su propio ADN (Ácido desoxiribonucléico o DNA). En este caso el objetivo es aprovechar dicha maquinaria para ver si una persona tiene el virus expandiéndose por su organismo. Vamos a aislar el ARN del virus, convertirlo en ADN y realizar millones de copias del material genético del virus que pueda llevar el paciente para poder “verlo”. Esto lleva varios pasos, cada uno de los cuales, veremos, puede afectar de forma importante al resultado final.

Lo primero de todo, dado que lo que queremos es conseguir aislar la parte del ARN del virus que infecta a la persona, es conseguir tomar muestras del virus presente en el tracto respiratorio. Las muestras en general proceden de frotis de vías aéreas profundas con hisopos orofaringeos, nasofaríngeos, aspìrados de estas dos zonas o lavados broqueoalveolares. Esta prueba permite ver el agente infeccioso presente y es necesario que haya una carga suficiente de virus en las vías respiratorias de donde se toma la muestra. La ventaja es que al ser muy sensible basta con que esta carga sea mínima. No obstante, es muy importante que la toma de la muestra sea realizada por personas cualificadas, que tomen adecuadamente estos frotis, lavados o esputos, recordando además que es una fase de riesgo para el operador. También, la manipulación y el transporte de las muestras debe ser adecuado. Un retraso en el envío o una mala conservación puede dar lugar a falsos negativos. Otros factores como la baja eliminación de virus en las zonas de toma de muestras, por estar en una fase temprana de infección, o por encontrarse, al contrario, en casos graves, puede también afectar a la recuperación. Por eso estamos viendo en la práctica habitual que, ante negativos en personas sospechosas, es necesaria una confirmación varios días después, o una priorización de los cuadros clínicos en la decisión.

El ARN se extrae de las envueltas del virus. Para ello se rompe la envuelta con reactivos de lisis y proteasas dejando libre y estable el ARN. Este extracto es el que permite realizar la prueba de PCR y copiar millones de veces los ácidos nucleicos originales del virus. Este paso de extracción va a ser también crítico, aunque los protocolos están bastante automatizados en los laboratorios clínicos, con plataformas de extracción que pueden procesar a la vez muchísimas muestras, es importante evitar fallos en la muestra, o contaminaciones cruzadas por su altísima sensibilidad.

Aunque tras este paso tenemos extraído el ARN (Cadena sencilla de ácido nucleico), la PCR funciona solo si trabajamos con ADN (Cadena doble de ácido nucleico). Por ello, se necesita convertir el ARN en una copia idéntica de ADN complementario mediante lo que se conoce como retrotranscripción. Este paso viene integrado en los pasos iniciales del propio desarrollo de los kits PCR. El resto de la reacción la realiza una enzima encargada de la replicación (una polimerasa especial “Taq”) junto con cebadores (pequeñas secuencias que hibridan zonas específicas del virus a buscar), una sonda de DNA marcada con un fluoróforo (que nos permitirá seguir el proceso de amplificación a tiempo real) y una molécula “secuestradora” de fluorescencia (“Quencher”) que evita que el primero haga su función cuando no hay amplificación. Todo ello en un medio adecuado en pH y sales para favorecer la reacción.

La PCR consiste en varias fases. Una primera fase inicial de Desnaturalización el DNA a  temperaturas de más de 90 °C para activar la taq y separar las cadenas de DNA obtenido. Tras ello se repite durante unos 40-50 ciclos lo siguiente. Una nueva desnaturalización en la que el ADN queda accesibles así a los oligonucleótidos y sondas, a la que sigue una hibridación y copia de cada una de las moléculas replicadas en cada ciclo anterior desde la original del virus. Cada vez que se copia, una de ellas, la sonda que se une a cada molecula existente, va a degradarse y emitir fluorescencia. En cada uno de los ciclos, se duplican las cadenas de DNA presentes en el anterior de forma que finalmente se obtiene un producto exponencial del gen. Si el virus está aparece una señal visible que incrementa con el tiempo, Si no está la señal base no aumentará.

Su fortaleza, además de confirmar los positivos en fase infectiva, nos va a permitir garantizar una gran parte de negativos. Un negativo en test rápidos se confirma con ella. La PCR se considera la prueba de referencia en este momento. En estimaciones iniciales se hablaba de una capacidad de hasta el 70-80% de detección, aunque en casos sintomáticos esta capacidad sube enormemente, (Yang et al. 2020), no obstante, durante el desarrollo de la pandemia se habrían llegado a perfeccionar hasta más del 85% su sensibilidad. Su uso en los laboratorios clínicos diseñados para altos volúmenes de muestra, con equipos automáticos de extracción permite procesar gran cantidad de muestras en cada ronda, pero aun así cada ronda necesita de varias horas de trabajo. Por otra parte, los equipamientos están localizados en los laboratorios habilitados y precisan de personal especializado. Esto significa que no pueden realizarse las pruebas “in situ” en las plantas o en los domicilios de las personas aisladas y que hay que añadir la dificultad del desplazamiento, toma de muestras, manipulación y transporte de las muestras, al tiempo y condiciones de las mismas. Además, al estar en un momento de pandemia, la alta demanda mundial provoca el riesgo de que algunos de los reactivos necesarios para la fabricación de estos sistemas tenga momentos de escasez o peor calidad ralentizando producciones y disponibilidad. Sobre todo se han visto problemas en componentes de los kits de extracción, más que en las PCR en sí (https://www.sciencemediacentre.org/expert-comments-about-reagents-needed-for-covid-19-swab-pcr-testing/).

  • Pruebas rápidas

Si las pruebas de PCR detectaban directamente el ARN del virus, las “pruebas rápidas”, también conocidos como de tipo “lateral flow” o POC (Point-Of-Care), van a buscar proteínas. Pero, ¿qué proteínas? Nos encontramos con dos tipos de test rápidos, y cada uno de ellos va a tener funcionalidades diferentes

Un primer tipo de test rápido tiene la misma orientación que los de PCR. En este caso localizar e identificar partículas de la parte proteica del virus, como, por ejemplo algunos desarrollos basados, proteínas de la nucleocápside o de los receptores externos. Es el primer tipo que se desarrolló. Su fortaleza es la rapidez de actuación ante un positivo y la posibilidad de realizarlo en cada uno de los puntos de decisión. Detecta también el virus activo, debe estar para detectarse en las vías respiratorias. Es un tipo de “screening” inverso, ya que, aunque los positivos son muy claros, los negativos tienen un alto porcentaje de falsos. Estos deberían confirmarse por PCR.

El segundo tipo de test inmunocromatográfico y que más desarrollos está teniendo en este estadio del brote, es el que no va a buscar el virus directamente, sino la respuesta del paciente a la presencia del virus. Son test serológicos. Se trata de kits rápidos que lo que detectan es principalmente los anticuerpos que el paciente genera, inmunoglobulinas de tipo M (Ig M) y de tipo G (IgG), en las fases inicial y adaptativa de la respuesta inmune a la infección respectivamente. Este tipo de kits han necesitado para su desarrollo de estudios de la respuesta de los pacientes al virus, y por ello han comenzado a aparecer como segunda oleada de herramientas diagnósticas. Su fortaleza, detecta qué personas han sido infectadas aunque ya hayan superado la enfermedad, y puede dar una idea de la fase en la que están.

¿Cómo funcionan este tipo de sistemas? Las tiras inmunocromatográficas se soportan generalmente en un filtro de nitrocelulosa, que puede ir protegida en un casete de fácil uso. En dicho soporte, existen al menos, dos puntos de anclaje de bandas de anticuerpos. (Tres en el caso de aquellos que detectan IgG e IgM policlonales específicas frente a la enfermedad) En la primera de ellas, la más cercana al frente por el que va a subir el extracto de las muestras, se sitúan los anticuerpos contra nuestro objetivo (proteína del virus o IgG, igM en cada caso). Una segunda (o tercera) banda es la de control, en ella los anticuerpos van a estar dirigidos a retener otro grupo de anticuerpos diferente a los específicos (General mente de otra especie) marcados que hayan conseguido escapar de las primeras.

La analítica por inmunocromatografía de flujo lateral es relativamente sencilla. Poniendo el ejemplo de los test rápidos serológicos al ser más sofisticados en diseño, la mecánica más o menos común sería:

Una muestra de sangre (suero o plasma también se contemplan) y se diluye con en un tampón de y se deposita directamente en la tira. Los anticuerpos IgG e IgM que puedan estar presentes van van a entrar en contacto con antígenos del virus marcados con partículas (Ej oro coloidal, partículas de látex coloreado, etc…)  De estar presentes en el paciente, las IgG e igM van unirse a ellos. y por capilaridad el conjunto comienza a “ascender” por el filtro de nitrocelulosa. También en ese punto va a haber anticuerpos inespecíficos de conejo unidos a partículas marcadas.

En su zona superior, las tiras llevan adsorbidas, tres zonas de anticuerpos adheridos a la tira: una banda de anticuerpos primarios frente a las IgG humanas a detectar, otra frente con anticuerpos contra las IgM humanas y una tercera línea después de las otras dos que va a retener anticuerpos de conejo inespecíficos marcados (Esta es la banda de control que asegura que la muestra ha pasado sin problemas por toda la tira sin detenerse).

Todas las IgG e IgM de la muestra quedan atrapadas en sus correspondientes bandas.  hay IgG o igM frente a coronavirus, queda atrapado también el antígeno marcado en la banda correspondiente. dando una línea de color (Muestra POSITIVA para esa IgG). El resto pasa hasta la línea de control donde quedan atrapados los anticuerpos de control marcados generando a su vez una última línea. Una línea en IgM denota fases relativamente iniciales de la respuesta, La aparición de IgG muestra fases más avanzadas. La aparición de solo la banda del control se considera un negativo. Si no se forma ninguna línea o falla la línea control, algo ha inhibido la unión o interferido en la subida por capilaridad y el análisis no es válido.

En el caso de los test de detección directa del antígeno viral, la mecánica es similar pasando a estar marcados anticuerpos frente al virus, de forma que este complejo es el objetivo de la primera banda de anticuerpos en este caso.

Una ventaja de los test rápidos es pueden llegar a agilizar la toma de decisiones clínicas y descentralizarla de los laboratorios principales, lo cual al final es una ventaja estructural en la toma de decisiones. Son de manejo sencillo y precisan pocos medios, pudiendo extenderse a más pacientes al descentralizarlos a cada una de las zonas de atención. Una pega es que los dispositivos rápidos que detectan el antígeno directamente (virus) parece que de momento tienen menores sensibilidades frente a pacientes asintomáticos o en primeros estadios, aunque en casos sintomáticos esta fiabilidad parece ser mucho mayor. Los test serológicos, por su parte, parecen presentar también limitaciones en etapas tempranas, y hace necesario reevaluar sobre todo negativos en función del historial y la clínica.

No olvidemos que los propios desarrollos siguen perfeccionándose a batalla, y que es necesario que vayan perfeccionando su sensibilidad, sobre todo en los casos de test de antígeno viral que han mostrado ser más conflictivos. A la hora de dar validez a estos resultados es cuando entran en juego una serie de instituciones en todos los países que se encargan de validarlos sobre la marcha, según se van adquiriendo, frente a la referencia PCR. En España, la institución encargada de este control y verificación es el Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III. Aquellos test que no pasan dicho control son descartados y devueltos.

Si decimos que la PCR es de momento el estándar de oro, pese a ciertas limitaciones que pueda tener ¿Existe algún motivo además de la necesidad de extender los puntos de control de forma sencilla que haga necesario el uso y perfeccionamiento de los test rápidos? La respuesta es sí, ya que, aunque estamos hablando de diagnóstico, no debemos olvidar que, a partir de ahora, este tipo de test va a tener una función si cabe más relevante, epidemiológicamente hablando. Son los que van a permitir comprobar qué personas ya han tenido contacto con el virus y se han inmunizado, conjuntamente con la PCR van a ser decisorios de qué personas están ya inmunizadas, pero no tiene carga infectiva.

Por último, cabe recordar que las pruebas en solitario son siempre incompletas y que es la combinación de pruebas, la experiencia clínica, el contexto de los pacientes y los datos epidemiológicos los que van a ser la mejor arma del personal sanitario cuyas decisiones son en las que debemos confiar en todo momento.

 

Referencias de interés:

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